В МНИОИ имени П.А. Герцена – филиале ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России создан прототип флуоресцентного устройства для оценки эпителио-мезенхимальной трансформации

Причиной более чем 90% смертельных исходов при онкологических заболеваниях является развитие метастазов. Новые стратегии лечения определяются глубиной понимания молекулярных механизмов формирования метастазов, которые на сегодняшний день ещё недостаточно раскрыты в силу сложности этого процесса. Каскад метастазирования последовательно включает следующие этапы: сначала будущая метастатическая клетка должна отделиться от первичной опухолевой массы, разрушить окружающий ее внеклеточный матрикс, проникнуть в кровеносный сосуд и циркулировать в кровотоке. Далее клетка должна прикрепиться к эндотелию в области целевого органа, проникнуть через стенку сосуда в соединительную ткань и начать процесс пролиферации, который приведет к возникновению клинически детектируемого метастаза.

Популярным подходом для изучения метастазирования является использование ксенографтных моделей на основе иммунодефицитных мышей. Подавление иммунитета у мышей не приводит к отторжению опухолевых клеток человека и позволяет формироваться первичной опухоли и метастазам в целевых органах, включая легкие и костный мозг. Недостатком такого подхода является невозможность учесть вклад нормальной иммунной системы в развитие онкологического заболевания и неадекватность оценки исследуемого терапевтического воздействия. Кроме того, фундаментальное различие мыши и человека на молекулярном и системном уровне зачастую не позволяет судить о процессах и механизмах развития рака у человека по результатам, полученным на модельных ксенографтных системах.

Экспериментальные системы изучения метастазирования in vitro обладают существенным преимуществом, поскольку они открыты для манипуляций и условия проведения эксперимента на всех этапах находятся под плотным контролем исследователя. На сегодняшний день существует широкий спектр подходов in vitro, моделирующих отдельные единичные этапы каскада метастазирования. Они включают, главным образом, простые статические тесты на миграцию и инвазию клеток, а также ограниченное число более сложных подходов, основанных на использовании микрофлюидных систем и направленных на воспроизведение нескольких взаимосвязанных этапов процесса образования метастазов.

В 2016 году группа научных сотрудников ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России под руководством профессора Б.Я. Алексеева выиграла грант Минобрнауки России на проведение научно-исследовательских работ по теме «Создание in vitro модели метастазирования солидных опухолей человека и разработка флуоресцентного устройства для оценки эпителио-мезенхимальной трансформации».

Исследование выполняется в рамках реализации федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 – 2020 годы» (Соглашение о предоставлении субсидии от 28 июля 2016 г. № 14.613.21.0058).

Благодаря разрабатываемой в рамках проекта in vitro модели метастазирования солидных опухолей станет возможным воспроизведение полного каскада метастазирования. Разрабатываемая система оптического мониторинга флуоресцентного сигнала позволит проводить наблюдения за поведением опухолевых клеток в чипе и регистрацию образования метастазов в режиме реального времени. Полученная система может быть использована для высокопроизводительного поиска потенциальных противоопухолевых лекарственных средств, мишенями которых будут являться определенные стадии каскада метастазирования.

Для выполнения задач проекта используются клеточные линии рака человека, экспрессирующие флуоресцентные молекулы-репортеры, которые позволяют оценивать эпителиальное и мезенхимальное состояние клеток в режиме реального времени. Для изучения метастазирования in vitro будет использоваться модифицированная микрофлюидная платформа на базе микробиореактора, позволяющая одновременно культивировать модели первичной опухоли и целевых органов метастазирования, объединённых одним контуром с постоянно циркулирующей клеточной средой.

На первом этапе работы были получены флуоресцентные репортеры: зеленый белок GFP, экспрессируемый под промотором гена Е-кадгерина (CDH1/GFP), в качестве репортера эпителиального состояния клеток и красный белок RFP, экспрессируемый под промотором гена N-кадгерина (CDH2/RFP), в качестве репортера мезенхимального состояния. Были созданы генетические конструкции для экспрессии этих репортеров в эукариотических клетках. На основании теоретического и экспериментального обоснования для создания клеточных культур с флуоресцентными репортерами была выбрана клеточная линия рака молочной железы MDA-MB–231. Были созданы клеточные линии, стабильно экспрессирующие репортеры CDH1/GFP и CDH2/RFP.

Помимо этого, были разработаны методики оценки соотношения эпителиальных и мезенхимальных клеток в статических условиях и в динамических условиях с использованием микрофлиюдного чипа, а также проведена оценка воспроизводимости методики анализа соотношения эпителиальных и мезенхимальных клеток в динамических условиях.

На втором этапе проекта было проведено тестирование узлов флуоресцентного устройства, спроектирован макет флуоресцентного устройства с горизонтальным расположением зеркал, проведены его испытания и выполнена оценка воспроизводимости технического решения макета флуоресцентного устройства.

Выбранная конструкция дала возможность в качестве детектора сигнала флуоресценции использовать не только фотоэлектронные умножители, но и цифровую видеокамеру, что позволило избежать погрешности измерения при малых количествах исследуемых клеток. Исходя из проведенных теоретических исследований в области спектральных характеристик оптических элементов для двух длин волн эмиссии были подобраны комбинации фильтров и дихроичных зеркал, которые позволили минимизировать потери полезного сигнала флуоресценции на оптическом тракте макета.

Помимо этого, была разработана методика применения флуоресцентного устройства для анализа метастазирования в микрофлюидном чипе в динамических условиях.

Разрабатываемую модель метастазирования предлагается использовать на этапе доклинических исследований для оценки эффективности потенциальных препаратов, снижающих метастатическую активность злокачественных новообразований, при этом разработанное флуоресцентное устройство может быть использовано не только для изучения метастазирования в рамках данного проекта, но и применяться в работе молекулярно-биологических лабораторий.

По результатам исследования были опубликованы следующие научные статьи:

О.А. Бурмистрова, М.Ю. Шкурников, C.В. Никулин, Г.С. Захарова, К.А. Фомичева, Б.Я. Алексеев. Новые флуоресцентные репортерные системы для оценки эпителиального и мезенхимального состояния клетки. Бюллетень экспериментальнойбиологии и медицины, 2018, Том 165, № 1, с. 104–109.

С.В. Никулин, М.П. Райгородская, А.А. Полозников, Г.С. Захарова, U. Schumacher, D. Wicklein, C. Sturken, K. Riecken, К.А. Фомичева, Б.Я. Алексеев, М.Ю. Шкурников. Роль белка IGFBP6 в регуляции генов эпителиально-мезенхимальной трансформации. Бюллетень экспериментальнойбиологии и медицины, 2017, Том 164, № 11, с. 605–610.

С.В. Никулин, М.П. Райгородская, А.А. Полозников, Г.С. Захарова, U. Schumacher, D. Wicklein, C. Sturken, K. Riecken, К.А. Фомичева, Б.Я. Алексеев, М.Ю. Шкурников. In vitro модель для изучения роли гена IGFBP6 в метастазировании рака молочной железы. Бюллетень экспериментальнойбиологии и медицины, 2017, Том 164, № 11, с. 646–651.

Подана заявка на изобретение №2017147027 от 29.12.2017 “Флуоресцентные репортерные системы для оценки эпителиального и/или мезенхимального состояния клетки”

Отдел трансляционной онкологии МНИОИ им. П.А. Герцена –филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России